农药在保障粮食安全方面发挥着重要作用，但对食品安全、生态保护和人类健康构成潜在威胁。通过微生物活性降解农药，作为一种安全、环境友好、实用的消除农药残留的方法，越来越受到人们的关注。虽然已经从环境中分离出许多拟除虫菊酯（一种农药）降解微生物，并提出了几种降解途径，但总体而言，编码拟除虫菊酯及其代谢产物降解酶的基因仍有待研究。拟除虫菊酯通常被认为是比毒性更强的有机氯和有机磷农药更环保的替代品，其中β-氯氰菊酯（β-CY）占全国拟除虫菊酯市场的50%以上。由于过量喷洒，β-CY残留在水果和蔬菜、河流和土壤中均被检测到，这可能对人类和环境建库产生长期影响。本研究旨在研究从绵羊瘤胃食糜中分离的一种细菌GW-01（蜡样芽孢杆菌）降解β-CY的相关酶基因以及代谢途径。

1.实验思路

2.实验材料：

从甘肃武威市的5岁健康雌性小尾寒羊的瘤胃糜样品中，通过共代谢分离得到β-CY降解菌株——蜡样芽孢杆菌GW-01菌株。

3.测序平台：

Illumina Miseq+Pacbio 、 Illumina HiSeq X Ten。

4.分析内容：

菌株形态和生理生化鉴定、细菌完成图测序、转录组测序、蛋白组测序、代谢组产物检测、基因克隆、载体构建及酶形态学分析等等。

1.GW-01菌株的特性分析

显微镜观察显示菌株GW-01是一个革兰氏阳性杆状菌，在光镜下产生出的孢子呈现圆形或柱状的中生或亚中生孢子。在37℃的LB培养基上孵育24h后，形成圆形或近圆形、柔软、无色素、直径在5-7mm、微亮的白色菌落（图1）。

图1：菌株GW-01革兰氏染色反应(a)、孢子染色(b)、LB琼脂平板菌落形态(c)、血平板菌落形态(d)。

基于16S rRNA系统发育树分析表明，菌株GW-01与Bacillus albus MCCC 1A02146, Bacillus luti MCCC 1A00359, Bacillus nitratireducens MCCC 1A00732和Bacillus tropicus MCCC 1A01406具有100%的相似性（图2）。基于全基因组的ANI分析发现，菌株GW-01与蜡样芽孢杆菌B4078的相似性值大于95%，则可说明GW-01菌株不是芽孢杆菌属的一个新种。病毒菌株GW-01的β-CY降解活性的诱导性质进行鉴定，发现诱导样品中膜组分对β-CY的降解显著高于未诱导样品（表1）。

图2 基于16S rRNA构建的蜡样芽孢杆菌GW-01与其相关菌株的系统发育树和GW-01全基因组圈图

表1 菌株GW-01 β-CY降解酶的诱导特性

2. 菌株GW-01生物降解β-CY特性研究

在100mg/L条件下，β-CY降解程度随着时间增加而增加（图3a），菌株GW-01的生物量在4d的时候达到最大值，而在5d后的生物量随着β-CY初始浓度的增加而减少（图3b），并在25mg/L的时候β-CY的降解量最大（87.6%）。以上结果表明，菌株GW-01降解β-CY的有效半衰期为4.49d（图3c），在高浓度的情况下似乎有毒性的低生物量的β-CY存在。为了进一步研究这种毒性，检测了菌株GW-01在不同浓度β-CY处理24h后的氧化应激反应，图3d、e、f、g显示了菌株GW-01的SOD、CAT、GST和T-AOC活性随着β-CY浓度的增加而显著升高。使用使用spearson相关分析分析了β-CY降解、菌株GW-01生物量、β-CY浓度和氧化应激参数之间的相关性(图3 h)，发现生物量与β-CY初始浓度、GST和CAT活性呈负相关。这些结果表明，β-CY的初始浓度是诱导菌株GW-01毒性氧化应激的决定因素。

图3：菌株GW-01对β - CY的降解及LB培养基中β - CY暴露后的氧化应激反应（a）不同时间β-CY降解（100mg/L）；（b）不同浓度β-CY处理5d后的降解程度；（c）GW-01在LB培养基中降解β-CY的一级降解动力学模型。0-200mg/L β-CY处理菌株GW-01 24h后，（d）SOD活性、（e）CAT活性、（f）GST活性、（g）T-AOC活性均显著降低。（h）β-CY浓度、β-CY降解、菌株GW-01生物量、SOD活性、CAT活性、GST活性和GW-01中T-AOC的Spearson相关性分析

3. β - CY生物降解产物的鉴定

通过GC-MS和HPLC鉴定β-CY生物降解产物（图4a），菌株GW-01的β-CY生物降解产物特征见表S3。图4b、c、d、e、f、g、h和i分别显示了GW-01对3-PBA、苯甲酸、苯酚和儿茶酚的降解情况。从图中可以看出，除3-PBA的降解生物量外，GW-01的生物量以及3-PBA、苯甲酸、苯酚和邻苯二酚的降解量在7d内均随时间增加而增加。此外，随着3-PBA和苯甲酸浓度的增加，生物量和3-PBA和苯甲酸的降解量降低。然而，在苯酚和儿茶酚降解过程中，观察到相反的情况，17.0%和15.1%的降解率随初始浓度的增加而增加。同时，对照组的生物量高于3-PBA、苯酚、苯甲酸和儿茶酚样品(图4c、e、g和i)，表明母质化合物和这些代谢物都对GW-01有毒。

图4：β-CY在GW-01培养物中生物降解的代谢物(a)经GC-MS鉴定的β-CY生物降解产物。初始浓度分别为50 (c)、12.5 (d)、25 mg/L (f)、25 mg/L (h)的3-PBA、苯甲酸、苯酚和邻苯二酚在7天内的生物降解时间历程。5 d后，3-PBA (c)、苯甲酸(e)、苯酚(g)和邻苯二酚(i)在不同浓度下的生物降解。

4. 组学分析

以菌株GW-01全基因组序列为基础，对β-CY降解酶及其代谢产物的编码基因和氧化应激相关蛋白进行转录组和蛋白组学分析。由于菌株GW-01能够降解β-CY及其代谢产物，在培养和降解过程中积累了大量的代谢物，有利于诱导相关基因和蛋白的表达。因此，将菌株GW-01置于LB培养基中，100mg/L，30℃，150rpm中培养36h，获得的细胞用于进一步研究。

4.1转录组学分析

转录组数据的初步统计分析显示，复制中的基因表达模式和β-CY暴露呈现正相关（图5a）。在菌株GW-01中，共差异表达434个基因，其中上调基因246个，下调基因188个（图5b）。差异表达基因数量最多的是“转运蛋白”，占上调基因的30.89%，其次是“糖酵解和糖质新生”（6.5%）和“丙酮酸代谢”（6.1%）（图5c）。下调基因类别最多的是肽酶和抑制剂（11.17%）和群体感应（7.98%）相关基因（图5d）。此外，参与柠檬酸循环(TCA循环)、运输、碳水化合物代谢、谷胱甘肽代谢、苯甲酸降解、药物代谢、细菌趋化性、丁酸代谢、核苷酸切除修复、DNA修复与重组蛋白、DNA复制蛋白、染色体和相关蛋白组也受到差异调节，表明这些组是细胞对β-CY及其代谢物直接反应的一部分，或者是与暴露相关的毒性反应。

图5-1：转录组分析：（a）对照和处理样本对应基因表达值的Pearson相关性。(b)差异表达基因火山图(>变化2.0倍);纵坐标为KEGG条目，横坐标为不同样本的基因计数，不同颜色代表不同富集程度。(c)和(d)分别表达上调和下调的基因

4.2蛋白组学分析

在菌株GW-01中共鉴定到2546个蛋白，其中有331个蛋白上调，403个下调，此为对照组的1.2倍（图5g）。通过使用层次聚类对重复进行分组，实验重复性非常好（图5e）。图5h显示了诱导组和对照组差异表达蛋白kegg通路显著富集，过氧化物酶体、药物代谢-细胞色素P450、细胞色度P450对外源药物的代谢作用和丁酸代谢途径均与β-CY的暴露相关。在GO注释中可知，β-CY暴露对代谢过程、解毒、催化活性和抗氧化活性组的蛋白质有不同程度的调节（图5f）。

图5-2 蛋白组分析：（e）处理组和对照组中表达蛋白的分类聚类（f）β-CY处理诱导的蛋白质功能分类，分为生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)三类。条形图上方的数字为富集因子，表示差异表达蛋白数量与GO标注的所有鉴定蛋白数量的比例。(g)差异表达蛋白火山图(>变化2.0倍);纵坐标为KEGG条目，横坐标为不同样品的蛋白计数，不同颜色代表不同富集程度。(h)在处理组和对照组比较的基础上，采用Fisher准确检验对差异表达蛋白对应的KEGG通路富集分析。

5. 基于多组学的降解基因联合分析

转录组和蛋白组变化趋势相同的基因的关联性结果如图6a所示，Pearson相关系数值为0.7956。表S4-A列出了在转录组和蛋白质组中均显示富集的KEGG通路，其上调的类别包括乙醛酸和二醛酸代谢、丁酸代谢、丙酸代谢、核苷酸切除修复、TCA循环等；下调的基因的代谢通路包括：有机酸跨膜、有机物氧化、有机酸代谢过程、前提代谢产物和能量的产生等途径。微生物降解β-CY和/或其代谢物的主要酶可能是水解酶、裂解酶、羟化酶、氧化酶和/或非特征蛋白。这些酶的表达上调和下调的基因见图6b、c、d、f，功能见表S5。大量编码类似功能的基因表明，它们的诱导是β-CY和/或其代谢物暴露诱导的广义应激反应。一些上调的水解酶、氧化酶、羟化酶和裂解酶可能在β-CY及其代谢物的降解中发挥作用。根据KEGG和Swiss-Prot注释，α/β水解酶(chr_3118)、金属依赖型水解酶(chr_505)、氯水解酶(chr_1781)、细胞色素aa3喹啉氧化酶(chr_678、679、680)可能编码β-CY及其代谢产物的降解酶。图6e中出现与氧化应激相关的基因上调或下调，过氧化氢酶(chr_1126)、超氧化物歧化酶[Fe- Mn] (chr_5269)、羟酰基谷胱甘肽水解酶(chr_942)、乳基谷胱甘肽裂解酶(chr_3176)下调；超氧化物歧化酶[Cu-Zn] (chr_4757)、乳基谷胱甘肽裂解酶(chr_3048,960)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、乳基谷胱甘肽裂解酶(chr_3048,960)、和5036)的表达上调，表明这些基因或蛋白的表达是由β-CY或其代谢物诱导的。

图6：基于多组学的降解基因联合分析。(a)具有相同变化趋势的DEGs和DEPs之间的相关性，DEGs和DEPs编码水解酶和裂解酶(b)、羟化酶(c)、氧化酶(d)、氧化应激酶(e)、转录组(外圈)和蛋白质组(内圈)中的非特征蛋白(d)。

6. 基于GW-01的β-CY转化酶的克隆与鉴定

鉴于大量编码相似功能的基因在β-CY暴露过程中存在差异表达，在5节中对酶进行了分析，以便进一步研究。β-CY及其代谢物降解，这些蛋白质根据表2所示，在体外实验中，很明显，α/β-水解酶基因(chr_3118)可以降低15.3%的β-CY(25 mg / L)， chr_1781 (氯水解酶)可以降低21.7%的苯酚(25 mg / L)。细胞色素aa3二酚氧化酶基因含有4个亚基，检测了编码3-PBA或3-苯氧基苄醇的单个亚基或这些亚基的混合蛋白对3-PBA或3-苯氧基苄醇的降解。该混合物对3-PBA (25 mg/L)的降解率为25.7%，但对3-苯氧基苄醇的降解率不高，而单个亚基不能降解3-PBA或3-苯氧基苄。通过GC-MS鉴定酶的降解产物，与氯水解酶编码的蛋白(chr_1781)反应后，在苯酚样品中检测到邻苯二酚(图S3)。与α/β-水解酶基因(chr_3118)和细胞色素aa3喹啉氧化酶基因(chr_677, 678, 679, 680)编码的蛋白反应后，样品中未检出产物。

1. 菌株GW-01从健康母羊瘤胃中分离得到，其个体形态和菌落形态、生理和生理功能均具有显著性差异；

2. 基于16S rRNA基因序列进行系统发育分析，全基因组比较表明该菌株为蜡样芽孢杆菌；

3.不同时间段SOD、CAT、GST活性及T-AOC的变化，表明β-CY诱导小鼠产生氧化应激反应。β-CY的降解似乎是由于最初的酯酶反应，产生3-PBA，被代谢为苯酚和苯甲酸，而在菌株GW-01进一步降解为柠檬酸循环中间体。进一步的这4个基因的表达和活性分析，表明这些基因预测编码的酶负责β-CY及其代谢产物的降解。