2024-04-22
随着进入后基因组时代，高通量测序方法和平台日趋完善，数据准确度显著提升，应用广泛。对样本进行高通量测序和生信分析，可以同时获得STR、SNP、Indel和mRNA等各种类型的分子遗传标记信息。
目前，SNP（单核苷酸多态性）已成为当下热门研究课题之一，其应用非常广泛。农业领域，能够进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定等；在医学领域，可进行疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、药物敏感或疾病易感性位点筛选等。
传统的SNP位点筛选的方法，包括一代直接测序法、SNaPshot法、LDR法、TaqMan探针法等，这些方法无论是成本，还是通量、周期，都无法满足越来越高的市场要求。那么有没有一种集通量、速度、成本及精确于一身的SNP检测方法？
KASP技术自面世以来，以其超高的灵活性、准确度和性价比，被业内称为“基因分型研究者指尖跳跃的珠链”。如何使用Kasp技术进行基因分型，今天我们就一起来看看吧！
一、Kasp技术介绍 KASP™ 是指竞争性等位基因特异性 PCR (Kompetitive Allele Specific PCR)，可对广泛的基因组 DNA 样品，包括复杂基因组 DNA 样品，对目标 SNPs 和 InDels 进行精准的双等位基因分型。 KASP技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光引物，它基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了LGC KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，比Taqman还具有更好的位点适应性，所以在医学、农学检测方面LGC KASP都有非常好的应用。 Kasp反应体系包括KASP Assay mix、KASP Master mix以及DNA模版。 KASP Assay mix：KASP引物混合物，含有根据要分型的SNP位点所设计的带有两个不同的独特接头序列（5’端）的竞争性等位基因特异性（3’端）正向引物，以及一个共用反向引物。 KASP Master mix：KASP主反应混合物，含有FRET试剂盒和Taq聚合酶。 DNA模版：带有目标SNP的待测DNA样本。 二、Kasp反应流程 第一轮反应：DNA模版变性，等位基因特异性引物与DNA模版的SNP位点配对并延伸，与通用反向引物一起扩增目的片段。 第二轮反应：等位基因特异性接头序列的扩增 在第二轮反应中，反向引物结合、延伸并对等位基因的特异性接头（下图红颜色的序列）序列进行扩增，即红颜色的序列会引入到SNP位点对应的PCR产物中。 第三轮反应：产生荧光信号 以新合成的含有特异性接头的序列为模版，荧光标记的通用探针与接头序列配对并延伸，从淬灭基团中释放出荧光，产生荧光信号。随着PCR循环数的提升，带有荧光信号的PCR产物累积，荧光信号加强，在反应结束后读取荧光数据。 三、Kasp技术的优势 1、分型结果准确（准确度>99.8%） 2、检测成本低 3、样本用量低 4、检测周期短 5、检测通量高 四、Kasp结果呈现 Kasp基因分型技术的结果为三个清晰的基因分型散点图。以图中结果为例，FAM 基因型位于 X 轴（蓝色的数据点），HEX 基因型位于 Y 轴（红色的数据点）， 绿色的数据点代表杂合基因型，黑色的数据点是阴性对照(NTCs)。96 孔板的排布显示的是每个样本DNA对应的基因型结果。 同时我们也会提供具体分型信息哦！如下表所示 1 C:C 10 C:C 19 C:T 28 T:T 37 C:C 2 C:C 11 C:C 20 C:T 29 C:C 38 C:C 3 C:C 12 C:C 21 C:T 30 T:C 39 T:C 4 C:T 13 C:T 22 C:T 31 C:C 40 C:C 5 C:C 14 C:C 23 T:T 32 T:T 41 C:C 6 C:C 15 C:C 24 T:T 33 T:C 42 C:C 7 C:C 16 C:C 25 C:T 34 T:C 43 T:T 8 T:T 17 T:T 26 C:T 35 C:C 44 T:C 9 C:C 18 C:C 27 C:T 36 T:C 45 C:C 五、Kasp的应用 Kasp技术基于引物3’末端碱基的特异匹配来对SNP进行分型，根据终端荧光的颜色进行判断。每孔采用双色荧光检测一个样本的一个SNP位点的可能基因型，不同SNP基因型对应不同的荧光产物。特别适用于高通量测序后的SNP验证、大样本量少SNP的验证，广泛应用于作物和动物育种、人类遗传病检测、药物基因组学、疾病易感性检测QTL精细定位、种子质量控制、大样本量的分子标记验证、分子辅助育种、种子资源鉴定等。 小伙伴们，有大样本量的SNP的验证，推荐使用Kasp技术哦！
